Análisis de la proteína rodopsina G

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 8243 (2022) Citar este artículo

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La esquistosomiasis es una enfermedad médicamente significativa causada por parásitos helmintos del género Schistosoma. El ciclo de vida del esquistosoma requiere interacciones mediadas químicamente con un huésped intermedio (caracol acuático) y definitivo (humano). Bloquear el desarrollo del parásito dentro de la etapa de caracol requiere una mejor comprensión de las interacciones entre el caracol huésped y la forma de vida libre transmitida por el agua de Schistosoma (miracidium). Las innovaciones en la genómica del caracol y la comunicación química acuática brindan una oportunidad ideal para explorar la coevolución caracol-parásito a nivel molecular. Los receptores acoplados a proteína de rodopsina G (GPCR) son de particular interés para estudiar cómo los parásitos trematodos navegan hacia sus huéspedes caracoles. El papel potencial de los GPCR en los parásitos los convierte en objetivos candidatos para nuevos antihelmínticos que interrumpen las etapas intermedias del ciclo de vida del huésped, evitando así infecciones humanas posteriores. Se utilizó un enfoque genómico-bioinformático para identificar ortólogos de GPCR entre el caracol Biomphalaria glabrata y los miracidios de su parásito obligado Schistosoma mansoni. Mostramos que 8 GPCR de rodopsina de S. mansoni expresados dentro de la etapa miracidial comparten una similitud general de aminoácidos con 8 GPCR de rodopsina de B. glabrata diferentes, particularmente dentro de los dominios transmembrana, lo que sugiere características estructurales conservadas. Estos GPCR incluyen un receptor de péptido huérfano, así como varios con fuertes homologías de secuencia con receptores de opsina rabdoméricos, un receptor de serotonina, un receptor de sulfaquinina (SK), un receptor de alatostatina-A (buccalina) y un receptor de FMRFamida. Los péptidos buccalin y FMRFa se identificaron en agua acondicionada por B. glabrata, y mostramos que buccalin sintético y FMRFa pueden estimular tasas significativas de cambio de dirección y respuestas de retroceso en S. mansoni miracidia. Se identificaron GPCR ortólogos en S. mansoni miracidia y B. glabrata. Estos GPCR pueden detectar ligandos similares, incluidos olores derivados de caracoles que podrían facilitar la búsqueda de huéspedes miracidiales. Estos resultados sientan las bases para futuras investigaciones que esclarezcan los mecanismos por los cuales los GPCR median en la búsqueda de huéspedes que pueden conducir al desarrollo potencial de nuevas intervenciones antiesquistosomas.

Los helmintos metazoarios del género Schistosoma son los principales agentes etiológicos de la esquistosomiasis humana, una enfermedad endémica en 74 países que afecta a más de 200 millones de personas en todo el mundo1. A nivel mundial, hasta 200 000 personas mueren directa o indirectamente debido a la esquistosomiasis anualmente2 y se estima que 600 millones de personas viven en áreas endémicas3. Los esquistosomas tienen un ciclo de vida dioico complejo, que involucra larvas reproducidas asexualmente en un huésped intermediario molusco y gusanos adultos sexualmente reproductivos en el huésped definitivo mamífero. En el agua, los huevos de Schistosoma mansoni se convierten en miracidios móviles de vida libre que deben buscar e infectar un caracol huésped compatible, Biomphalaria glabrata4. Después de la infección, un solo miracidio puede reproducirse asexualmente a través de esporoquistes de madre e hija, en varios miles de cercarias que, cuando se liberan, pueden convertirse en un gusano adulto en el huésped humano. Los complejos cambios fisiológicos y morfológicos asociados con el ciclo de vida de Schistosoma significan que el control antropogénico de la transmisión podría estar dirigido a varias etapas del ciclo de vida. Actualmente, los gusanos adultos suelen ser el objetivo del tratamiento de humanos infectados con el fármaco praziquantel5. Sin embargo, la enfermedad sigue siendo una amenaza constante en los países en desarrollo y la Organización Mundial de la Salud ha reconocido que se requiere continuar la investigación sobre la etapa de infección del caracol6. Por ejemplo, los métodos alternativos para interferir con el ciclo de vida del esquistosoma podrían implicar la aplicación de fármacos antihelmínticos que se dirijan al comportamiento de búsqueda del huésped de los miracidios o las cercarias7,8.

Los esquistosomas miracidios tienen una visión restringida y un tiempo limitado (12 a 16 h) para encontrar un caracol huésped apropiado9. La identificación del huésped implica una variedad de respuestas conductuales que promueven la localización del huésped, lo que aumenta la probabilidad de una infección exitosa10,11. Compartir el mismo entorno de vida con el huésped intermedio hace que la etapa de miracidios sea un punto ideal para interrumpir el ciclo de vida del parásito y representa una ventana objetivo para evaluar los componentes moleculares necesarios para encontrar huéspedes. Se producen dos respuestas conductuales principales que comprenden una fase inicial de dispersión y direccional influenciada por la mediación de fotorreceptores, y una fase secundaria de búsqueda y circulación (quimiocinesis) que está mediada por el olfato7,12,13,14. Hasta la fecha, hay poca información disponible sobre los mecanismos moleculares subyacentes que dictan la detección del huésped mediada por el olfato por esquistosomas miracidios, aunque recientemente se descubrió un péptido de B. glabrata que induce cambios de comportamiento en los miracidios15.

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) son bien reconocidos como receptores quimiosensoriales en eumetazoos16 y son un enfoque de investigación prometedor para comprender la búsqueda de parásitos. Los GPCR y las vías bioquímicas posteriores se utilizan a menudo como objetivos farmacológicos selectivos para la interrupción del ciclo de vida del parásito17,18 y, por lo tanto, pueden ser objetivos efectivos para la manipulación de los miracidios. A nivel molecular, hay algunos informes sobre la biología del receptor de S. mansoni y las vías de transducción de señales, como el descubrimiento de una serie de proteínas de tipo sensorial codificadas por el genoma19,20. Estos incluyen GPCR21 que pueden interactuar con ligandos químicos, un concepto respaldado por análisis proteómicos y de expresión funcional que identificaron GPCR en los miracidios y la matriz tegumentaria adulta de los esquistosomas11,22,23. El escrutinio del genoma de S. mansoni reveló numerosas secuencias de GPCR de tipo rodopsina utilizando una combinación de tres algoritmos bioinformáticos, incluidos Phobius, HMMerSearch y Pfam scan24,25. Los expresados en los miracidios incluyeron dos receptores de opsina, que pueden sustentar el comportamiento fotocinético de los miracidios26,27.

La información emergente muestra que la estrecha asociación del caracol y su parásito esquistosoma obligado ha ayudado a dar forma a sus respectivos genomas. La variabilidad genética del huésped caracol, en lugar del huésped humano, puede ser un factor más significativo que influya en la variabilidad de los rasgos de la historia de vida en los esquistosomas28,29,30. Por ejemplo, se ha observado que la presencia de proteínas de mucina homólogas entre el caracol y diferentes cepas de S. mansoni pueden ser elementos clave subyacentes a la compatibilidad parásito-huésped del caracol31. Esto es consistente con el descubrimiento de una homología significativa de las regiones 5' y 3' no codificantes de las secuencias nimbo de retrotransposón de repetición terminal no larga; estos elementos transponibles de clase I se copian y pegan en diferentes ubicaciones genómicas, en el huésped y el parásito, lo que sugiere una posible transferencia horizontal de secuencias del huésped al parásito32,33.

En este estudio, identificamos GPCR similares a rodopsina de S. mansoni miracidia que comparten una identidad de secuencia significativa con GPCR similares a rodopsina en B. glabrata. Este nuevo conocimiento guió los bioensayos de comportamiento de péptidos en S. mansoni miracidia que demostraron que FMRFa y los péptidos de buccalina pueden provocar comportamientos consistentes con el hallazgo del huésped.

La conducta y los procedimientos relacionados con la experimentación con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación Médica QIMR Berghofer (número de proyecto P242). Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

Se obtuvieron hígados de ratones ARC Swiss infectados con S. mansoni (cepa puertorriqueña) en las condiciones especificadas por el Departamento de Agricultura, Pesca y Silvicultura de Australia (DAFF). Los ratones fueron sacrificados con gas CO2 y sus hígados fueron perfundidos con PBS enfriado. Se recogieron huevos de S. mansoni durante la perfusión de ratones. Se cortaron cuatro hígados de ratón infectados con hojas de bisturí y se mezclaron hasta obtener una consistencia suave en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se utilizó un protocolo de dos días para obtener huevos de esquistosomas relativamente limpios y miracidios34. En resumen, la mezcla de huevos y tejido hepático de ratón se incubó con colagenasa B, penicilina y estreptomicina a 37 °C durante la noche, seguido de fraccionamiento utilizando columnas Percoll (8 ml de Percoll + 32 ml de sacarosa 0,25 M en tubos de 50 ml). Los gránulos de huevo se lavaron usando PBS dos veces en una segunda columna de Percoll (2,5 ml de Percoll + 7,5 ml de sacarosa 0,25 M en un tubo de 15 ml). Los huevos purificados se transfirieron a un cilindro de medición de eclosión de 200 ml envuelto completamente en cinta negra que bloqueaba la luz con la exclusión de los 4 cm superiores del labio, produciendo así un gradiente de luz. El cilindro de incubación se cubrió con agua MilliQ de pH neutro hasta ~ 1,5 cm por encima del área cubierta con cinta y se expuso a una luz brillante a 27 °C. Los huevos se incubaron durante 6 h después de la eclosión y se recogieron los 10 ml superiores de agua que contenía miracidio para el aislamiento de miracidio. Los miracidios eclosionados se aislaron por centrifugación a 8000 × g durante 1 min a 4 °C y se lavaron dos veces con agua. Para el aislamiento de ARN, los miracidios se recolectaron 6 h después de la eclosión y se mantuvieron a -80 ℃. El ARN total se aisló de S. mansoni miracidia (6 h después de la eclosión por triplicado) usando el reactivo TRIzol siguiendo la guía del usuario del fabricante (Invitrogen, EE. UU.), la cantidad y calidad del ARN se evaluó mediante espectrofotometría UV (NanoDrop ND-1000) y la El ARN se envió a NovoGene (Hong Kong) para la plataforma Illumina 2500 de próxima generación RNA-seq. Los datos de secuencia sin procesar se depositaron en GenBank NCBI con el número de acceso SRR17224866. El ensamblaje del transcriptoma de novo de los datos de secuencia sin procesar de S. mansoni miracidia se realizó con Trinity, como se describió anteriormente35,36, y los contigs se tradujeron en secuencias de proteínas con Transdecoder35. Los niveles de expresión génica de S. mansoni miracida se calcularon mapeando datos de secuencia sin procesar contra el genoma de referencia de S. mansoni derivado de WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/) utilizando CLC Genomic Workbench con parámetros predeterminados37.

La tubería para la identificación de GPCR ortólogos compartidos entre B. glabrata y S. mansoni se muestra en la Fig. 1. Para B. glabrata, los datos sobre GPCR y sus niveles de expresión en diferentes tejidos se recuperaron de un estudio anterior6. Con S. mansoni, se buscaron secuencias de proteínas derivadas de transcriptomas para perfiles basados en Pfam y dominios TM para identificar receptores que pertenecen a la familia GPCR de rodopsina. Específicamente, esto incluía dos herramientas bioinformáticas para predecir dominios TM para todas las proteínas, incluidos TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) y Phobius (http://phobius.sbc.su. sí/). Como los dominios TM son marcadores convenientes para los GPCR, solo nos enfocamos en aquellas secuencias con dominios 7-TM. Luego, aplicamos una búsqueda de perfil basada en Pfam utilizando HMMerSearch (http://www.hmmer.wustl.edu/). Las proteínas que contenían supuestos dominios GPCR de tipo rodopsina se identificaron sistemáticamente mediante búsquedas de modelos de Markov ocultos de perfil utilizando el paquete HMMer (http://www.hmmer.wustl.edu/) y el modelo PFAM PF00001 (7tm_1).

Flujo de trabajo para la identificación de GPCR compartidos extraídos del genoma y transcriptoma de B. glabrata de S. mansoni miracidia.

Los GPCR putativos identificados en S. mansoni miracidia se usaron para consultar (usando tBLASTp) la base de datos de GPCR de B. glabrata. Aquellas secuencias con valores E < 1,0E-20 se recuperaron y examinaron para determinar la presencia de motivos transmembrana recurrentes usando TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Los que contenían 7 dominios transmembrana (TM) se seleccionaron para su posterior análisis. Se crearon múltiples alineaciones de secuencias con el software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versión 6.038 con el algoritmo MUSCLE39. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando el método de unión de vecinos con 1000 réplicas de arranque para soporte de nodos. El mapeo de ontología génica y la anotación funcional se aplicaron utilizando OmicsBox (BioBam)40. El árbol filogenético final y el mapa de calor se modificaron con iTOL v541.

FMRFa sintético (FMRF-NH2), buccalin (RLDRFGFAGQL-NH2) y SK (NYGDYGIGGGRFGR) fueron proporcionados por China Peptides (Shanghai, China) (pureza ≥ 95%). La serotonina (5-hidroxitriptamina/5-HT) fue proporcionada por Sigma (Burlington, Estados Unidos) (pureza ≥ 98%). Se prepararon soluciones madre de FMRFa (100 μM), buccalin (100 μM), SK (100 μM) y 5-HT (5 nM) disolviéndolas en agua MilliQ. Se usó agua MilliQ como control negativo en los bioensayos.

El aislamiento de S. mansoni miracidia ~ 2 h después de la eclosión se realizó como se describe en Wang et al.21. Para cada ensayo, 30 ± 5 miracidios que nadan activamente en agua MilliQ con pH neutro (~ 4 ml en total) se distribuyeron uniformemente con una pipeta en la región central de una placa de Petri (100 mm × 15 mm) que contenía 4 ml de agua MilliQ. El área de natación de los miracidios se cubrió para evitar el sesgo de luz antes del análisis bajo el microscopio. Para los ensayos, se agregaron 2 µl de solución de prueba al área central de la placa de Petri. Se esperaba algo de difusión de cada molécula durante el período de prueba de 1 min. Los ensayos también se probaron en diluciones en serie de 10 × y 100 ×. Para registrar el movimiento de los miracidios antes y después de la adición de las soluciones de prueba, se utilizó un microscopio compuesto invertido con capacidad de video (OLYMPUS CKX41), equipado con una cámara de microscopio digital OLMPUS DPI DP22 (imagen de 2,8 megapíxeles a una velocidad de 15 fotogramas por segundo). usado. El campo de visión (FOV) de la cámara real era de 2.500 × 1.875 mm. El movimiento de Miracidia se registró durante 1 minuto antes y después de la adición de cada solución de prueba y los videos capturados se procesaron utilizando Tracker 4.87.

Las trayectorias de Miracidia se rastrearon manualmente desde la entrada al FOV hasta la salida, o hasta 1 minuto para aquellos que permanecieron dentro del FOV. Solo se incluyeron los miracidios que habían estado nadando por más de la longitud del borde corto (7,5 cm) del FOV antes y después de la adición de la solución (Archivo S1); los que no lo hicieron se consideraron estadísticamente sin sentido. La duración promedio de los miracidios que permanecen dentro del FOV se consideró como otra característica clave del comportamiento y se comparó estadísticamente. Para aquellos miracidios que permanecieron durante más de 1 min después de la adición de la solución, se usó la duración del tiempo dentro de ese 1 min como comparación y se calculó el valor medio de la aceleración. La aceleración y la velocidad del miracidio se calcularon en función de las trayectorias, con unidades convertidas a cm s-2 y cm/s. Se usó una prueba t de dos colas pareadas para calcular los valores de P; además, cuando correspondía, se realizó un análisis ANOVA de dos vías42 para evaluar la importancia de los cambios (aceleración, velocidad y tiempo) entre las soluciones de prueba y el control negativo.

Para identificar si los ligandos peptídicos candidatos estaban presentes en el agua acondicionada con B. glabrata, se tomaron dos enfoques. En primer lugar, se buscaron datos de espectrometría de masas derivados de análisis previos de agua43 acondicionada con B. glabrata utilizando proteínas precursoras diana.

En segundo lugar, se realizó un análisis de transferencia de puntos mediado por anticuerpos usando extractos de agua acondicionados de B. glabrata. B. glabrata se lavaron con agua MilliQ de pH neutro y se colocaron en vasos de precipitados que contenían 20 ml de agua durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Se retiraron los caracoles, se recogió agua acondicionada de 20 caracoles (en diferentes acuarios) y se añadieron 20 ml de metanol a cada vaso de precipitados y se mezcló completamente. El agua acondicionada se filtró a través de unidades de filtro de jeringa PVDF Millex-HV (0,45 µm) para eliminar partículas y microbios. El filtrado se congeló instantáneamente y se liofilizó. Para los controles negativos, el agua no expuesta previamente a los caracoles se procesó de manera similar. Cuando fue necesario para el ensayo dot bot, las muestras se rehidrataron con 200 μl de agua MilliQ y se centrifugaron a 12 000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se recogió y se diluyó 1:1 en agua MilliQ. La cuantificación se realizó con un espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.) a A280nm. Se aplicaron extractos de B. glabrata a 5 g\(\upmu\)/\(\upmu\)l, 500 ng/\(\upmu\)l y 50 ng/\(\upmu\)l (2 μl) sobre una membrana de nitrocelulosa (0,45 m\(\upmu\), BioRad, Hercules, EE. UU.) que se había empapado previamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 × y se había secado al aire a temperatura ambiente durante 10 min. La membrana se incubó en tampón de bloqueo (leche descremada al 2 % (v/v) en PBS) durante 1 h y se añadió el anticuerpo primario [1:500; anti-buccalin44 de conejo, anti-FMRFa de conejo (Genscript, Piscataway, EE. UU.), anti-5-HT de rata (Sigma)] durante 1 ha TA. Las membranas se lavaron con PBS-Tween20 (0,1 % (v/v)) y se incubaron durante 1 ha TA con anticuerpo secundario [1:5000; anti-conejo Ig-IR 680 (LI-COR, Lincoln, EE. UU.) o anti-rata Ig-IR 795 (LI-COR)]. Después de los lavados (3x, 5 min) en PBST, las transferencias se visualizaron usando una máquina Odyssey CLx, LI-COR.

Los datos de la secuencia sin procesar transcriptómica miracidial de S. mansoni se depositaron en GenBank NCBI con el número de acceso SRR17224866 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=SRR17224866). El genoma de referencia de S. mansoni está disponible en WormBase Parasite (https://parasite.wormbase.org/Schistosoma_mansoni_prjea36577/Info/Index/). El conjunto de datos original de la proteína B. glabrata está disponible en VectorBase (https://vectorbase.org/vectorbase/app/downloads/Current_Release/BglabrataBB02/fasta/data/).

En total, se extrajeron 96 proteínas con dominios 7-TM de los modelos de proteínas derivados del transcriptoma de S. mansoni basados en la predicción TMHMM. La predicción de Phobius condujo a la identificación de 139 proteínas con dominios 7-TM. El perfil de Pfam de ambas predicciones condujo a la clasificación de 87 proteínas (valor E < 0,0004) como receptores de tipo rodopsina. El análisis BLASTp de estos GPCR frente a todos los GPCR de rodopsina de B. glabrata mostró coincidencias significativas (valor E < 1,0E−20) para 8 GPCR (Tabla 1), con una identidad de aminoácidos entre el 26 y el 48 % (Archivo S2a). Las búsquedas BLASTp utilizando todos los GPCR ortólogos de S. mansoni y B. glabrata contra la base de datos no redundante (nr) del NCBI arrojaron los mejores resultados de coincidencia para los GPCR, incluidos 5-HT (serotonina), alatostatina tipo A (AST-A), FMRFa, SK, orexina tipo 2, neuropéptido F, péptido huérfano y GPCR similares a opsina (Tabla 1, Fig. 2A y Archivo S2b). En B. glabrata, todos los GPCR se expresaron en el SNC, mientras que el GPCR rodopsina huérfano tuvo la distribución tisular más amplia (Fig. 2B). En S. mansoni miracidia, se encontró que el ortólogo GPCR de rodpopsina mostraba el nivel promedio más alto de expresión, en comparación con otros receptores (Fig. 2B).

Caracterización de ortólogos de GPCR compartidos entre B. glabrata y S. mansoni miracidia. (A) Análisis de árbol filogenético de GPCR compartidos, donde cada GPCR de B. glabrata se agrupa con un receptor ortólogo de S. mansoni. Los valores de Bootstrap respaldan los niveles de confianza de los clados. (B) Mapa de calor que muestra la expresión de genes que codifican GPCR (en TPM) compartidos en S. mansoni miracidia a las 6 h después de la eclosión y diferentes tejidos de B. glabrata. Las columnas representan réplicas biológicas de S. mansoni miracidia (1–3) y su media, así como tejidos de Biomphalaria (glabrata).

La elucidación de ortólogos de GPCR entre especies con ligandos putativos presentó una oportunidad para investigar cómo las biomoléculas derivadas de caracoles influyen en S. mansoni miracidia. El 5-HT es un neurotransmisor eumetazoario bien establecido, mientras que los neuropéptidos FMRFa de B. glabrata, la bucalina [reconocida como homóloga de AST-A en moluscos45] y SK se han identificado previamente en B. glabrata6,46, por lo que se analizó su bioactividad en miracidios. Las trayectorias del movimiento miracidial antes y después de la adición de los péptidos FMRFa y buccalin (2 µl a 100 µM) se comparan en las Fig. 3A,B. Las películas representativas se pueden ver en Películas S1 y S2. Antes de la adición, los miracidios generalmente nadaban a través del campo de visión en una trayectoria lineal directa (Fig. 3A,B—Antes). Después de la aplicación, los miracidios mostraron un movimiento localizado dentro del FOV, así como un aumento de la natación circular (Fig. 3A,B—Después). Tras la aplicación de péptidos buccalin o FMRFa, los miracidios dentro del FOV nadaron durante más tiempo, excepto buccalin a 10 µM (valor P = 0,2964) (Fig. 3C). El cambio en la aceleración fue significativo después de la adición de buccalin o FMRFa (100 µM y 10 µM) (Fig. 3D). Los péptidos estimularon un patrón de natación concentrado alrededor de la ubicación de los péptidos.

Ensayo de comportamiento miracidial utilizando péptidos buccalin y FMRFa. (A) Trayectorias representativas del movimiento miracidial antes y después de la adición de la solución buccalin (100 μM) al centro del área de grabación. Cada color representa un individuo de miracidio indistinguible. Consulte la película S1 para ver un video de ensayo representativo. (B) Trayectorias representativas del movimiento de miracidios antes y después de la adición de la solución FMRFa (100 μM) al centro del área. Cada color representa un individuo de miracidio indistinguible. Consulte la Película S2 para ver un video de ensayo representativo. (C) Gráfico de la duración del tiempo de los miracidios que permanecen en la zona de video y (D) valores medios de aceleración, antes y después de la adición de buccalin y FMRFa.

En contraste, luego de la aplicación de 5-HT (5 nM; Película S3), el tiempo dentro del FOV fue insignificante, pero el cambio de aceleración fue significativo (Archivo S3). Los péptidos (100 µM) dieron como resultado que los miracidios permanecieran más tiempo en la región donde se agregó el péptido, pero no hubo un cambio significativo en la velocidad promedio, como lo indica el análisis ANOVA de dos vías (Archivo S4). Tampoco hubo cambios significativos en el tiempo dentro del FOV, ni en la velocidad promedio, tras la adición del péptido SK a 3 concentraciones diferentes (100 µM, 10 µM y 1 µM; Película S4). Como controles negativos, se probó el agua MilliQ en S. mansomi miracidia y no se observaron cambios de comportamiento.

El precursor de bucalina de B. glabrata contiene numerosos péptidos similares a bucalina (Fig. 4A). La región más conservada en las buccalinas es un FXGGIG C-terminal, que después del procesamiento postraduccional se convierte en un péptido amidado. Las transferencias de puntos realizadas en extractos de agua acondicionada de B. glabrata mostraron la presencia de un péptido similar a buccalina en diluciones de extracto de 10 μg a 0,1 μg (Fig. 4B). El precursor de FMRFa de B. glabrata contiene numerosos péptidos relacionados con FMRFa (FaRP), incluidos FMRFa, FLRFa y FIRFa (Fig. 4C). El análisis de los datos de espectrometría de masas proteómica derivados del agua acondicionada con caracol de B. glabrata sin tratamiento previo43 identificó 4 coincidencias de péptidos para el precursor FMRFa, aunque no específicamente dentro de ningún FaRP. Las transferencias de puntos realizadas en extractos de agua acondicionada de B. glabrata mostraron la presencia de péptidos similares a los FaRP en diluciones de extracto de 10 μg a 0,1 μg (Fig. 4D).

Secuencia precursora de Biomphalaria glabrata y ensayo de transferencia puntual para buccalina y FMRFa en agua acondicionada con B. glabrata. (A) Secuencia precursora del neuropéptido Buccalin (B) Transferencia de puntos usando anti-buccalin en extractos acuosos acondicionados de B. glabrata a 10, 1 y 0,1 mg. (C) Secuencia precursora del neuropéptido buccalin. (D) Transferencia de puntos usando anti-FMRFa en extractos de agua acondicionados de B. glabrata a 10, 1 y 0,1 g\(\upmu\). -ve Control representa solo extracto de agua purificada. Para las secuencias precursoras, amarillo: péptido señal, rojo: sitios de escisión putativos, verde: amidación, gris: péptidos bioactivos, rosa: coincidencias de péptidos de MS.

S. mansoni miracidia responde a biomoléculas derivadas de caracoles43, aunque la identidad precisa de la(s) biomolécula(s) activa(s) no se ha definido claramente. Un estudio implicó a las "glucoproteínas que atraen los miracidios" presentes en el moco del caracol12, mientras que el análisis in silico de las proteínas del agua acondicionada del caracol B. glabrata predijo las interacciones de las proteínas no caracterizadas de S. mansoni con las proteínas de B. glabrata43. También se ha implicado a los péptidos, por lo que un nuevo péptido derivado del caracol (denominado P12) estimuló cambios en el comportamiento de S. mansoni miracidia47.

En este estudio, para reducir las biomoléculas potencialmente involucradas en la interacción del parásito y el huésped, utilizamos recursos genéticos de B. glabrata y S. mansoni para identificar los GPCR ortólogos que probablemente sean utilizados por cada organismo para detectar ligandos similares. Informamos que 8 GPCR de S. mansoni miracidia comparten una identidad significativa con 8 GPCR de B. glabrata, no solo en el mapeo GO, sino también dentro de las regiones correspondientes a los dominios TM putativos. Estos incluyen GPCR con similitud con los GPCR de neuropéptidos que se unen a FMRFa, AST-A/buccalina y péptidos de sulfaquinina. Proponemos que los GPCR ortólogos miracidiales se pueden usar para la señalización neuronal, lo que requiere un ligando común y/o se usan para detectar biomoléculas semioquímicas presentes en el agua. Esta última expectativa fue validada por cambios en el comportamiento de los miracidios en presencia de FMRFamida de caracol y péptidos AST-A/buccalin.

La AST-A y su receptor se han caracterizado en varios insectos48 donde están involucrados en múltiples funciones como la inhibición de la biosíntesis de hormonas juveniles y la reducción de la ingesta de alimentos48. Se han identificado neuropéptidos similares a AST-A en gasterópodos y moluscos bivalvos, incluida Lottia gigantea, Theba pisana, Aplysia californica y Crassostrea gigas49,50,51,52. Buccalin, denominada así tras su primera identificación en el músculo accesorio rádula más cercano de A. californica53, se ha implicado en diversas actividades en moluscos como la inhibición de la contracción muscular, la regulación de la alimentación y el desove53,54,55. También en gasterópodos y bivalvos, el receptor AST-A/buccalina se identificó mediante análisis in silico de conjuntos de datos genómicos disponibles públicamente, incluido el de B. glabrata56. En nuestro estudio, identificamos un ortólogo del receptor AST-A/buccalin en S. mansoni, aunque no hay informes de que S. mansoni tenga un péptido similar a buccalin. De hecho, una investigación exhaustiva de neuropéptidos de 10 especies de platelmintos mostró que solo el turbelario de vida libre Macrostomum lignano tiene un péptido similar a la buccalina (gen npp-9; GAYSGFLG)57. Identificamos un péptido similar a la buccalina en el agua acondicionada de B. glabrata. A pesar de que no se ha investigado bien la presencia de neuropéptidos en las secreciones mucosas, previamente identificamos neuropéptidos (incluida la bucalina) dentro del moco de las glándulas salivales del caracol terrestre T. pisana58,59.

El FMRFa se descubrió por primera vez en la almeja dura Mercenaria mercenaria y se cree que tiene un papel pleitrópico en la fisiología de los moluscos60,61,62,63. Amplios estudios realizados en el caracol de agua dulce Helisoma mostraron que FMRFa y péptidos relacionados están densamente concentrados no solo en el sistema nervioso sino también dentro de las glándulas salivales64. Se ha identificado un receptor FMRFa en el corazón y tejido nervioso del caracol terrestre Helix62,65 y en la membrana del lóbulo óptico del calamar Loligo pelei66. El genoma de S. mansoni contiene un gen que codifica un precursor de FLP (gen npp-13) que puede procesarse para liberar dos péptidos de RFamida (HFMPQRFa e YTRFVPQRFa)57. Un FLP sintético (GNFFRFa) derivado de precursores de platelmintos no esquistosomas estimula la contracción de las fibras musculares de S. mansoni in vitro67. También se ha informado de un receptor de FLP en el platelminto turbelario Girardia tigrina en base a la similitud de secuencia y un ensayo de movilización del receptor de calcio68. El receptor homólogo en S. mansoni miracidia se investigó en el presente estudio debido a su similitud con el receptor FMRFa de B. glabrata. Nuestros ensayos de comportamiento también indicaron que S. mansoni miracidia puede detectar FMRFa derivado de caracol debido a que permanecen significativamente más tiempo en FOV y la mayor aceleración de miracidia, respaldada por la presencia observada de péptidos precursores de FMRFa en B. glabrata agua acondicionada. Sin embargo, como S. mansoni tiene el potencial de generar FLP endógenos, no podemos descartar la posibilidad de que el FMRFa aplicado pueda estimular los efectos endógenos, lo que lleva a los cambios de comportamiento miracidiales observados.

La monoamina 5-HT juega un papel fundamental en la transmisión neuronal y ha sido muy bien documentada en los eumetazoos, al igual que la conservación de los GPCR de 5-HT. En adultos de S. mansoni, la 5-HT estimula la actividad motora69, mientras que en los miracidios, un enfoque inmunofluorescente localizó la 5-HT dentro de los nervios sensoriales70. El 5-HT GPCR se identificó dentro de nuestro análisis de ortólogos de GPCR entre especies, pero encontramos que el 5-HT a 5 mM no modificó el comportamiento de los miracidios, mientras que el cambio significativo en la aceleración podría atribuirse a su alta concentración.

La sulfaquinina es un neuropéptido sulfatado mejor conocido por su función como factor de saciedad (ingesta de alimentos)71. La extracción de datos in silico mostró que la SK de moluscos tiene la secuencia de amida RF(W) C-terminal común a las sulfaquininas de insectos, así como el motivo DY compartido por las SK de insectos y la colecistoquinina de vertebrados (CCK)72. Dado que las CCK de vertebrados y las SK de insectos revelan una función biológica similar relacionada con la secreción de enzimas digestivas, la saciedad y la contracción del músculo liso73, es posible que sus contrapartes de moluscos hayan conservado actividades biológicas básicas similares. Por el contrario, no hay una SK obvia en S. mansoni, lo que sugiere que el parásito solo puede reconocer la SK de B. glabrata, ya sea como un semioquímico secretado, o una vez que penetra en el caracol como un péptido guía para navegar hasta el hepatopáncreas donde prolifera74 . Nuestros ensayos de comportamiento demostraron que SK no alteró el comportamiento miracida (ni la velocidad ni la duración presentes bajo FOV se vieron afectados) y, por lo tanto, es más probable que actúe como un estímulo interno en S. mansoni.

FMRFa y los péptidos buccalin pueden contribuir a un cóctel de biomoléculas que podrían usarse como un atrayente efectivo específico de la especie. Nuestros ensayos de dilución en serie sugirieron una bioactividad sostenida para los péptidos buccalin y FMRFa a una concentración de al menos 1 µM. También informamos 1 ortólogo de GPCR de péptido huérfano dentro de B. glabrata y S. mansoni miracida, lo que es consistente con la posibilidad de que péptidos específicos de especies no caracterizados podrían ayudar a atraer miracidios al caracol huésped apropiado debido a su presencia en muchos tejidos de B. glabrata y su alto nivel de expresión en S. mansoni miracidia.

Para minimizar la transmisión y reducir la prevalencia de la esquistosomiasis, la interferencia con la interacción caracol-miracidio es un plan prometedor de biocontrol. Caracterizamos los GPCR ortólogos compartidos entre B. glabrata y S. mansoni miracidia, biomoléculas importantes comúnmente utilizadas para la comunicación quimiosensorial. Los GPCR de buccalina y FMRFa de B. glabrata representaron buenos objetivos para el bioensayo, cuyos resultados indicaron que buccalin y FMRFa estimularon cambios de comportamiento miracidiales, a pesar de que los homólogos de péptidos similares a buccalina no están presentes en S. mansoni. Estos GPCR podrían presentar nuevos objetivos para el desarrollo de compuestos antihelmínticos que se aplicarán a los lagos e interferir específicamente con la detección de Schistosoma del huésped caracol. Para una mayor especificidad de especie, sugerimos que la desorfanización del péptido huérfano ortólogo GPCR será más ventajosa. Estos hallazgos ayudan aún más a nuestra comprensión de la interacción quimiosensorial entre los parásitos y sus huéspedes, particularmente dentro de los ambientes acuáticos.

Receptores acoplados a proteína G

Modelos ocultos de Markov

Análisis de genética evolutiva molecular

Solución salina tamponada con fosfato

PBS con 0.1% Tween 20

4,6-diamidino-2-fenilindol

paraformaldehído

Campo de visión

5-hidroxitriptamina

sulfaquinina

Sistema nervioso central

Espectrometría de masas

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Agradecemos a la Universidad de Sunshine Coast (USC) que proporcionó una subvención interna para apoyar este trabajo. Agradecemos la ayuda de Catherine Mainwaring de USC. Esta investigación se llevó a cabo con la asistencia de recursos de la Infraestructura Computacional Nacional (NCI), que cuenta con el apoyo del Gobierno de Australia. DPM es miembro de liderazgo del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud y científico principal en QIMR Berghofer. Los caracoles B. glabrata fueron proporcionados por el NIAID Schistosomiasis Resource Center of the Biomedical Research Institute (Rockville, MD) a través del contrato NIH-NIAID HHSN272201000005I para su distribución a través de BEI Resources. Reconocemos el consorcio del genoma de Biomphalaria que proporcionó un recurso invaluable para las secuencias de genes obtenidas en este estudio.

Este trabajo fue apoyado por el Australian Research Council (ARC, DP180103694_ to SFC, TW, DM). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Centro de Bioinnovación, Universidad de Sunshine Coast, Maroochydore, QLD, 4558, Australia

Phong Phan, Di Liang, Min Zhao, Conor Fogarty, Tianfang Wang y Scott F. Cummins

Facultad de Ciencias, Tecnología e Ingeniería, Universidad de Sunshine Coast, Maroochydore, QLD, 4558, Australia

Phong Phan, Di Liang, Min Zhao, Conor Fogarty, Tianfang Wang y Scott F. Cummins

Departamento de Biología, Universidad St. Francis Xavier, Antigonish, NS, B2G2W5, Canadá

Russell C.Wyeth

Laboratorio de Parasitología Molecular, QIMR Berghofer Medical Research Institute, Brisbane, QLD, 4006, Australia

Mary G. Duke y Donald P. McManus

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Concibió y diseñó el estudio y supervisó el proyecto: SFC y TW Realizó el estudio y el análisis de datos: PP, DL, CF, MZ y MD Contribuyó al análisis utilizando varias herramientas: DL, MZ y TW Redactó el artículo: PP, DL , RW, DPM y SFC Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Phong Phan o Scott F. Cummins.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Phan, P., Liang, D., Zhao, M. et al. El análisis de los ortólogos del receptor acoplado a la proteína rodopsina G revela péptidos semioquímicos para la interacción del parásito (Schistosoma mansoni) y el huésped (Biomphalaria glabrata). Informe científico 12, 8243 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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Recibido: 13 enero 2022

Aceptado: 25 de abril de 2022

Publicado: 17 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11996-x

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